Sprawozdanie z badań
Poniżej publikujemy sprawozdanie z przeprowadzonych badań
Sprawozdanie merytoryczne wniosku o przyznanie pomocy złożonym w ramach działania M16 „ Współpraca„ pt;” Wprowadzenie innowacyjnych rozwiązań w zakresie produkcji zwierzęcej w SK Michałów” w ramach umowy nr 00104.DDD.6509.0074.2022.13 zawartej w dniu 18.10.2023, realizowanego w oparciu o Program Rozwoju Obszarów Wiejskich na rok 2014/2020 .
Podstawowym celem projektu było opracowanie i wdrożenie innowacyjnych rozwiązań w zakresie hodowli koni czystej krwi arabskiej będących narzędziami służącymi do zwiększenia konkurencyjności i efektywności hodowli. Kluczowe elementy projektu obejmowały:
Innowacje zostały opracowane i następnie wdrożone poprzez współpracę pomiędzy Stadniną Koni Michałów a placówka naukową – Instytutem Zootechniki PIB. Prace grupy operacyjnej zmierzały do opracowania i wdrożenia:
1. Innowacyjnej, udoskonalonej, metody organizacji (pracy) i zarządzania hodowlą koni w oparciu o nowoczesne narzędzia i rozwiązania oparte na selekcji przy użyciu markerów genetycznych – MAS w dziale hodowli koni w celu intensyfikacji postępu hodowlanego.
2. Innowacyjnej, udoskonalonej technologii pozyskiwania i oceny nasienia ogierów czystej krwi w oparci o metody omiczne. Obie ww. innowacje dotyczył w sposób pośredni produktów rolnych wskazanych w Zał. 1 do Traktatu o funkcjonowaniu UE: koni i nasienia ogierów. Projekt został ukierunkowany na bezpośrednie, praktyczne zastosowanie rezultatów wypracowanych poprzez badania aplikacyjne i prace rozwojowe. Zarówno precyzyjna selekcja koni czystej krwi w oparciu o markery umaszczenia, zdrowotności, potencjału sportowego i wyścigowego, jak i zabezpieczenie rezerwy genetycznej koni poprzez bankowanie nasienia ogierów, spowodowała wzrost opłacalności i konkurencyjności produkcji zwierzęcej w stadninie.
Na osiągnięcie celu głównego składały się następujące cele szczegółowe:
1. Cel szczegółowy: Modernizacja Europejskiego Centrum Rozrodu Koni poprzez przeprowadzenie modernizacji oraz zakupu innowacyjnego sprzętu analizującego parametry i jakość nasienia. Cel szczegółowy skupia się na przygotowaniu bazy i zaplecza infrastrukturalnego i sprzętowego umożliwiającego wdrożenie opracowanych innowacji. W ramach pomocy zakupiono: samochód ciężarowy ISUZU, analizator nasienia ANDROID CASA, fantom dla ogiera z hydraulicznym ustawieniem i nachyleniem, 2 pojemniki MVE CryoShipper SC4/2V do transportu zamrożonego materiału biologicznego, zbiornik kriogeniczny MVE CryoSystem 6000 Full Auto.
2. Cel szczegółowy: przeprowadzenie badań przy zaangażowaniu pracowników obu partnerów grupy operacyjnej, a następnie pilotażowe wdrożenie wypracowanych rozwiązań – wprowadzenie Selekcji MAS i zabezpieczenie rezerwy genetycznej „Pure Polish” oraz opracowanie charakterystyki genetycznej populacji za pomocą technik sekwencjonowania następnej generacji (NGS).
Badania służące osiągnięcia celu szczegółowego obejmowały zabezpieczenie materiału biologicznego od 624 koni czystej krwi arabskiej do probówek typu EDTA. DNA wyizolowano przy użyciu kitu (Sherlock A&A). Aby uzyskać najlepszą wydajność procesu, minimalne stężenie DNA wynosiło 50 ng/µl, przy wartości współczynnika absorbancji DNA 260/280 około 1,8 (NanoDrop – Thermo Scientific, Massachusetts, USA). Zgenotypowano 82 225 markerów SNP przy wykorzystaniu mikromacierzy Equine80select_24 BeadChip Array (Illumina, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcją producenta – Infinium HTS. Obrazowanie mikromacierzy wykonano za pomocą skanera mikroamacierzy iScan (Illumina, Kalifornia, USA). Otrzymane dane przeanalizowano w programie Genome Studio (Illumina, Kalifornia, USA). Klastrowanie opierało się na standardowych plikach .egt dostarczonych przez firmę Illumina. Uzyskane genotypy sprawdzono pod kątem jakości poprzez ocenę współczynnika call rate. Do dalszej analizy wykorzystano jedynie próbki, których wartość współczynnika call rate wynosiła powyżej 95%.
Każdy osobnik został przeskanowany za pomocą macierzy zawierającej 82 255 loci. indywidualna analiza osobnicza obejmowała filtrację monogenów, oraz cech kompleksowych o znanym podłoży genetycznym takich jak: wodogłowie (B3GALNT2), karłowatość (ACAN) warianty (D1-D4), wrodzona ślepota (TRPM1), zawinięte końcówki uszu (TSHZ1), astemia skórna (PPIB), naked foal syndrome (ST14), osteochondroza (FAF1; FCN3; COL1A2), abiotrofia móżdżku (MUTYH), dysfunkcja worków powietrznych-GPT (ARHGAP24), umaszczenia podstawowe: kary (MC1R), rozjaśnienia umaszczeń podstawowych -srebro (PMEL), mushroom (MFSD12) deresz, wzory białych plam W11, W26, W16, W13, W21, SB1, W24, W14, W8, W5, W1, W20, W17b, W17a, W22, W2, W4, W9, W15, W27, W18, W19, W10, W6, W23, W3, W25, W12, W28, W7 (wszystkie warianty KIT, PAX3), płatki sniegu (SLC45A2) cream (SLC45A2), perła (SLC45A2), pręgowanie (MBTPS2), wysokość w kłębie (LCORL, HMGA2), struktura włosia (SP4), odporność na equine influenza (Mx), odpowiedź immunologiczna w kierunku infekcji wirusowych (RNASEL), epidermolysis bullosa – pęcherzowe oddzielanie się naskórka (LAMA2, LAMA3), oddzielanie ściany kopyta (HWSD) (SERPINB11), ciężki złożony niedobór odporności (SCID) (PRKDC), okresowy paraliż hyperkalemicznych (HYPP) (SCN4A), Trombastenia Glanzmanna (GT) (ITGA2B), hipertermia złośliwa (RYR1), osobowość (DRD4), posłuszeństwo (HTR1A), nawracająca choroba obturacyjna -RAO (IL4R), Occipitoatlantoaxial Malformation (OAAM), zespół niewrażliwości na androgen (AIS).
Na podstawie otrzymanych wyników badań genetycznych, omicznych i rodowodowych grupa operacyjna opracowała panel danych selekcyjnych dla cech o najistotniejszym znaczeniu ekonomicznym i populacyjnym w dziale hodowli koni czystej krwi arabskiej. Dzięki wprowadzeniu selekcji MAS rozpoczęto monitorowanie chorób genetycznych dotychczas nie oznaczanych na wczesnym etapie planowania hodowli. Znajomość wariantów odpowiadająca za wzory i odmiany oraz pozwoliła na monitorowanie wad takich jak niebieskie oko, duże obszary różowej skóry czy intensywne wzory widoczne szczególnie na koniach maścistych.
Zastosowanie macierzy genomowych pozwoliło również na oszacowanie inbredu genomowego dla całej populacji jak i poszczególnych osobników. W genomach współczesnych koni nagromadziły się szkodliwe mutacje genetyczne, co jest wynikiem historycznych wąskich gardeł populacyjnych. Zjawiska te miały miejsce podczas udomowienia koni oraz tworzenia konkretnych ras. Proces ten, zwany „kosztem udomowienia”, polega na tym, że niekorzystne mutacje zwiększają swoją częstość, „podczepiając się” pod obszary genomu podlegające silnej selekcji. Oprócz tego mutacje te mogą się rozpowszechniać w wyniku chowu wsobnego, selektywnej hodowli czy dryfu genetycznego.
Skutkiem obecności takich mutacji w genomie może być pogorszenie ogólnej kondycji koni, w tym spadek płodności. Jednak warto zauważyć, że dzięki wielopokoleniowej selektywnej hodowli część tych niekorzystnych mutacji mogła zostać usunięta z populacji współczesnych koni. Istnieją dowody na to, że w genomach koni domowych występują regiony objęte pozytywną selekcją, w których znajdują się geny związane z rozwojem. Sugeruje to, że hodowcy mogli skutecznie wpływać na poprawę płodności i ogólnej kondycji koni poprzez odpowiednie praktyki hodowlane.
W ramach operacji podjęto również oszacowanie inbredu genomowego, tzw. „ciągów homozygotyczności” (ang. runs of homozygosity, ROH). ROH to długie, ciągłe fragmenty DNA, w których obie odziedziczone kopie chromosomu (od ojca i matki) są identyczne. Zazwyczaj mają one wspólne pochodzenie przodków, co pozwala na określenie pokrewieństwa genetycznego między osobnikami oraz zjawiska autozygotyczności. Dzięki temu analiza ROH stała się przydatnym narzędziem do szacowania poziomu inbredu. Wykorzystuje się w tym celu współczynnik inbredu genomowego (FROH), który oblicza się jako stosunek sumy długości wszystkich ROH dla danego osobnika do całkowitej długości genomu.
W porównaniu do klasycznych metod szacowania inbredu opartych na rodowodach (FPED), współczynniki genomowe, takie jak FROH, pozwalają na bardziej precyzyjne określenie zjawiska inbredu oraz ocenę poziomu autozygotyczności nawet wtedy, gdy brak jest informacji o rodowodzie. Analiza wykazała, 4 klasy długości ROH:
0.5-1 33735
1-2 56837
2-4 19972
>4 13163
FIGURA
Oraz wartości dla inbredu genomowego w zależności od chromosomów oraz szacowana wartość inbredu dla populacji FIGURA .
Dzięki analizie wysp ROH, czyli obszarów w genomie często poddawanych presji selekcyjnej, wykazaliśmy geny, które mogą wpływać na ważne cechy hodowlane. Regiony te są szczególnie interesujące, ponieważ mogą skrywać tzw. QTL – fragmenty DNA odpowiedzialne za dziedziczenie konkretnych cech ilościowych, takich jak wydajność, zdrowie czy wygląd zwierząt. W analizowanej populacji, regiony pod presją selekcyjną obejmują takie geny które związane są jakością okrywy włosowej co przypuszczalnie związane jest z adaptacją organizmu do warunków pogodowych, odpornością na infekcję (Echinococcus multilocularis), czy cechy morfometryczne. (FIGURE PLOT MANHATTAN).
Przeanalizowano i zabezpieczono się rezerwę hodowlaną populacji „Pure Polish” poprzez biobankowanie materiału biologicznego pochodzącego od 10 ogierów hodowli państwowej i prywatnej w celu ochrony banku genów i różnorodności biologicznej dla przyszłych pokoleń hodowców.
15. Ibrahim or. ar. 1899 imp. 1907 Antoniny
Ogier Ibrahim został zakupiony do Antonin w 1907 roku. Sam bardzo urodziwy pozostawi po sobie typowe i równie urodziwe potomstwo. Niestety wraz z większością stada z Antonin zaginął w czasie działań wojennych. I wojnę światową przeżyło tylko 3 jego synów i prawdopodobnie ród by zaginął gdyby w 1913 roku nie sprzedano do `Anglii ogiera Skowronek (od Jaskółka po Rymnik), konia o ogromnej urodzie i typie, a także niezwykłym potencjale genetycznym. W 1920 roku trafił do hodowli używany aż do śmierci w 1926 roku. Do Polski krew Ibrahima wróciła przez Nabor (od Łagodna po Posejdon) zakupionego z Tierska w 1955 roku syna ogiera Negatiw (od Taraszcza po Enwer Bey) i wnuka ogiera Naseem (od Nasra po Daoud). Nabor krył w latach 1956 – 63, głównie w Michałowie, gdzie pozostawił szereg bardzo urodziwego potomstwa. Sam Nabor został w 1963 roku sprzedany do USA. W 1961 roku polscy hodowcy wykorzystali okazję i zakupili ojca Nabora, ogiera Negatiw, który został bardzo szeroko użyty zarówno w Janowie Podlaskim jaki i Michałowie, pozostawiając wybitne matki. Kontynuatorem rodu okazał się Bandos, syn bardzo cennej Bandoli (po Witraż), stanowił we wszystkich ówczesnych stadninach przez blisko 14 lat. Z synów Bandosa najszerzej użyty został Pepton (od Pemba po Czort), który dał kilku wartościowych potomków, w tym „wcielenie Skowronka” ogiera Ecaho (od Etruria po Palas). Najcenniejszym synem Bandosa okazał się Eukaliptus, który zostawił grupę doskonałych córek, jednak żaden z jego synów nie dorównał mu klasą.
Ród Ibrahima niesie w sobie ogromną urodę, a klacze, wywodzące się od reprezentantów tej linii, są wspaniałymi i cennymi matkami.
15. Ibrahim or. ar. 1899 imp. 1907 Antoniny
SKOWRONEK (Jaskółka) siwa, 1909, Antoniny
NASEEM (Nasra) siwa, 1922, Tiersk
NEGATIW (Taraszcza) siwa, 1945, Tiersk
BANDOS (Bandola) siwa, 1964, Janów Podlaski
PEPTON (Pemba) siwa, 1977, Janów Podlaski
ECAHO (Etrutia) siwa, 1990, Janów Podlaski
SALAR (Saba) siwa, 2000, Janów Podlaski
16. Ilderim or. ar.
Ilderim został importowany do stadniny w Sławucie w 1900 roku, niestety zginął podczas rewolucji wraz z całym sławuckim stadem. Po I wojnie światowej na terenie Polski pozostał tylko 1 syn Ilderima, ogier Bakszysz (od Parada po Rymnik), który trafił do Janowa Podlaskiego, gdzie krył w latach 1920-1923 i 1929. Najszerzej wykorzystano w hodowli jego syna ogiera Fetysz (od Siglavi Bagdady po Siglavy Bagdady or.ar.). Rola kontynuatora rodu przypadła urodzonemu w 1931 roku Miecznikowi (od Koalicja po Koheilan IV). Syn Miecznika, Aquinor (od Amneris po Amurath Sahib) okazał się kontynuatorem rodu. Z jego synów najlepiej w kraju spisał się Eleuzis (od Ellenai po Wielki Szlem), który w Janowie Podlaskim krył dwa lata, pozostawiając dwóch następców. Jeden z nich, Partner (od Parma po Aswan) krył w Polsce aż do swojej śmierci w 1994 roku, pozostawiając cenne klacze oraz szereg synów użytych w hodowli. Jednym z nich był Penitent (od Penza po Faher), który okazał się cennym, lecz krótko użytkowanych reproduktorem (w 1988 roku sprzedano go do USA). Kontynuatorem rodu został jego syn Eldon (od Erotyka po Eufrat) dając cenne i urodziwe potomstwo. Drugim, obiecującym i utytułowanym synem Partnera był urodzony w Białce Pesal (od Perforacja po Ernal), który po karierze hodowlanej w Polsce został sprzedany do Holandii.
Ogiery z tego rodu charakteryzują się dużą żeńskością.
16. Ilderim or. ar. 1894 imp. 1900 Sławuta
BAKSZYSZ (Parada) siwa, 1901, Sławuta
FETYSZ (Siglavi Bagdady) siwa, 1924, Janów Podlaski
MIECZNIK (Koalicja) siwa, 1931, Janów Podlaski
AQUINOR (Amneris) siwa, 1951, Klemensów
ELEUZIS (Ellenai) siwa, 1962, Janów Podlaski
PARTNER (Parma) siwa, 1970, Janów Podlaski
PESAL (Perforacja) siwa, 1991, Białka
PALATINO (Palmeta) siwa, 2006, Janów Podlaski
18. Krzyżyk or. ar.
Założyciel tego najstarszego polskiego rodu, ogier Krzyżyk or.ar. został importowany w 1876 roku do Jarczowiec. Ród został przedłużony tylko przez jednego z jego synów – ogiera Krzyżyk I (od Zulejma II po Hami), który został zakupiony do Jabłonowa, gdzie urodził się jeden z trzech jego synów użytych w hodowli – Mlech I (od Dora po Mlech). Dalej ród ten został przedłużony przez ostatniego syna Mlecha I, ogiera Abu Mlech (od Łania po Al Nabi), który krył w Janowie Podlaskim przez 3 sezony, zostawiając zaledwie kilka źrebiąt. Była wśród nich Dziwa (matka Ofira) oraz Enwer Bey (od Koalicja po Koheilan IV). Krył on w Janowie przez 2 lata, ale ze względu na obniżoną płodność zostawił jedynie kilka sztuk potomstwa, w tym klacz Taraszcza, która w Tiersku dała ogiera Negatiw. Jedynym synem Enwer Beya, który został w Polsce był Trypolis (od Kahira po Farys II) używany w czasie okupacji w Janowie. Po wojnie krył również w Albigowej, Klemensowie i Nowym Dworze. Kontynuatorem rodu ponownie okazał się tylko jeden syn – Faher (od Ferha po Kuhailan Abu Urkub). Z trzech jego synów, tylko El Azrak (od Ellora po Witraż) zasłużył się dla polskiej hodowli zostawiając w Janowie Podlaskim doskonałego Banata (od Bandola po Witraż). Ostatnim użytym synem Banat był Arbil (od Arba po Comet), który stanowiąc zarówno w Janowie jaki i Michałowie zostawił cenne córki, oraz 6 synów, z których tylko Wachlarza (od Warsowia po Tallin) użyto w państwowej hodowli. Sam Arbil reprezentował typ mocnego, ale urodziwego kuhailana, nie był wolny od wad kończyn, zwłaszcza tylnych. Stanowił 10 lat, pokrył 141 klaczy, odsadzono 87 źrebiąt, w hodowli użyto jego 5 synów i 34 klacze. Ród ten niesie za sobą silny typ kuhailański, dający wytrzymałość, twardość i zdrowie pustynnego araba.
18. Krzyżyk or. ar. 1869 imp. 1871 Jarczowce
KRZYŻYK I (Zulejma II) gniada, 1886, Jarczowce
MLECH I (Dora) gniada, 1897, Jezupol
ABU MLECH (Łania) siwa, 1902, Jezupol
ENWER BEY (Koalicja) siwa, 1923, Janów Podlaski
TRYPOLIS (Kahira) siwa, 1937, Janów Podlaski
FAHER (Ferha) siwa, 1953, Albigowa
EL AZRAK (Ellora) kara, 1960, Albigowa
BANAT (Bandola) gniada, 1967, Janów Podlaski
ARBIL (Arba) gniada, 23.01.1981, Janów Podlaski
WACHLARZ (Warsowia) skarogniada, 1990, Michałów
FORMAN (Formia) skarogniada, 2011, Michałów
ZŁOTY OWOC (Zlota Olza) ciemnogniada, 2020, Michałów
21. Kuhailan Haifi or. ar.
Odbudowując hodowlę koni czystej krwi arabskiej po I wojnie światowej w Gumniskach, książę Roman Sanguszko zatrudnił do jej prowadzenia Bogdana Ziętarskiego. W 1930 roku, przykładem swoich przodków, zorganizował wyprawę po konie do Arabii. U koczujących w okolicach Jauf plemienia Ruala, po raz pierwszy ujrzał Kuhailana Haifiego. Wrażenie jaki ten ogier na nim wywarł podsumował słowami: „Pierwszy raz przy kupnie konia doznałem uczucia, że mdleję.” Urodę ogiera opisywał tak „…niewielki, suchy, na doskonałych nogach…Szyja długa, łeb szlachetny, choć niezbyt suchy, nozdrza rozdęte, cienkie i ruchome, wspaniała odsada ogona.”. Karierę hodowlana rozpoczął już w 1932 roku, stanowiąc klacze m.in. z Gumnisk, Janowa Podlaskiego, Breniowa i Pełkiń. Niestety padł już w 1934 roku, pozostawiając niewielką liczbę potomstwa, ale pośród nich był wspaniały Ofir (od Dziwa po Abu Mlech – jednej z najcenniejszych klacz okresu międzywojennego).
Ofir został szeroko użyty w PSK Janów Podlaski. Uważany za najlepszego ogiera jaki urodził się w Janowie Podlaskim w okresie międzywojennym, charakteryzował się niewielkim wzrostem. Stanowił 19 lat, pokrył 219 klaczy, odsadzono 147 źrebiąt, w hodowli użyto jego 11 synów i 48 córek. Niestety prawie całe jego potomstwo zostało zabrane do ZSRR w 1939 roku lub padło podczas działań wojennych. Pozostało tylko kilka córek oraz czterech synów, z których Wyrwidąb (1938) został zabrany do Niemiec, Witeź II (1938) zabrany do USA (bardzo zasłużony dla tamtejszej hodowli) oraz Wielki Szlem (1938) i Witraż (1938), które zostały użyte do hodowli w Polsce.
Najbardziej zasłużył się w polskiej hodowli Wielki Szlem (od Elegantka po Bakszysz). Dał on potomstwo urodziwe i dzielne. Jego syn Czort (1949, od Forta po Kuhailan Abu Urkub) sam biegał doskonale i takie też dawał w większości potomstwo, stanowił 14 lat, pokrył 98 klaczy, odsadzono 66 źrebiąt, w hodowli użyto jego 15 synów i 27 córek.
Jego inny syn – El Paso (od Ellora po Witraż) był wypożyczony do USA, gdzie zdobył tytuł Championa USA. Po powrocie do kraju został szeroko użyty w hodowli – stanowił 7 lat, pokrył 121 klaczy, odsadzono 73 źrebięta, w hodowli użyto jego 12 synów i 38 córek. Jego uroda i wspaniały rodowód predysponowały go na cennego reproduktora. Tymi słowami opisywał go dyrektor Andrzej Krzyształowicz: „Prawidłowej budowy, ładna szyja i ładnie zawieszona głowa, choć ta głowa nie bardzo arabski. Prawidłowa budowa, z eleganckim, trochę „z kolana” ruchem. Kończyny poprawne. Oko dobre, duże, ciemne.”
Bardzo zasłużył się w hodowli drugi syn Ofira – Witraż (od Makata po Fetysz). Był on urodziwszy od Wielkiego Szlema i dawał też piękniejsze potomstwo, ale już nie tak dzielne na torze wyścigowym. Dyrektor Krzyształowicz tak go opisywał: „Koń o wybitnej urodzie arabskiej. Ładna głowa, bardzo duże, ciemne oko, duże nozdrza, ładna szyja, dobry korpus a mniej poprawne nogi.”. Jedyną jego cecha ujemną była nadmierna pobudliwość, którą często przekazywał. Stanowił 15 lat, pokrył 178 klaczy, odsadzono 139 źrebiąt, w hodowli użyto jego 15 synów i 27 córek.
Jednym z synów Witraża sprzedanym do USA w 1963 roku był Bask (od Bałałajka po Amurath Sahib) nazywany ”objawieniem Ameryki”. Zdobył on szereg Championatów USA, był wybitnym reproduktorem, ojcem championów i championek, dał ponad 1000 sztuk potomstwa w USA. Jednym z jego najcenniejszych synów w USA był Gdańsk (od Gdynia po Comet) łączący w sobie krew obu tych wspaniałych reproduktorów. Do Polski krew Baska wróciła za sprawą sprowadzonego do Michałowa kasztanowatego ogiera Monogramm (od Monogramma po Knippel), decyzja dyrektor Ignacego Jaworowskiego okazała się epokowa dla michałowskiej hodowli. W państwowej hodowli najdłużej użytkowani byli dwaj synowie Monogramma: siwy Ekstern (od Ernestyna po Piechur), multiczempion pokazów w Polsce i na świecie oraz Ganges (od Garonna po Fanatyka) łączący w sobie cechy „polskiego araba” – dzielny na torze wyścigowym i piękny na pokazach w ręku.
21. Kuhailan Haifi or. ar., urodzony w 1923, importowany w 1931 do Gumnisk
OFIR (Dziwa) gniada, 1933, Janów Podlaski
WITRAŻ (Makata) gniada, 01.04.1938, Janów Podlaski, wymiary: 153-180-19,0
BASK (Bałałajka) gniada, 1956, Albigowa
NEGATRAZ (Negotka) gniada, 2.02.1971, Patterson Arabians (US)
MONOGRAMM (Monogramma) kaszt., 1985, Patterson Arabains (US)
EKSTERN (Ernestyna) siwa, 1994, Michałów, wymiary: 151-172-18.0
PRADO (Pętla) siwa, 2005, Janów Podlaski
CANOVA (Carrara) siwa, 2009, Katarzyna Ostrowska
EDMUND (Editha) gniada, 2016, Michałów
PETRUS PA (Piwonia) gniada, 2018, PPH Parys Sp. z o.o.
GANGES (Garonna) gniada, 1994, Michałów,
EPICURUS (Ellissima) gniada, 2020, Michałów
WIZERUNEK (Wizawa) ciemnogniada, 2019, Michałów
Materiał biologiczny w postaci ejakulatów pobrano w SK Michałów w Europejskim Centrum Rozrodu zwierząt, do przeprowadzenia badań dotyczących identyfikacji markerów genetycznych dla parametrów jakości nasienia wykorzystano innowacyjny i intuicyjny system analizy jakości nasienia ogierów zakupiony w ramach operacji. Dzięki nowoczesnej technologii pobrane nasienie zostało precyzyjnie ocenione co pozwoliło na dalsze badania molekularne różnicowych cech. Materiał biologiczny w postaci ejakulatów pobrano do probówek typu kroi i przetransportowano do laboratorium w ciekłym azocie. RNA wyizolowano za pomocą kitu PureLink i oczyszczoną z pozostałości genomowego DNA przy wykorzystaniu DNAzy. Dodatkowo, RNA zwizualizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 2%, aby ocenić stopień jego degradacji. Próbki o ilości 400 ng całkowitego RNA została wykorzystana do przygotowania bibliotek cDNA przy użyciu zestawu TruSeq RNA Kit v2 (Illumina) zgodnie z instrukcjami producenta. Jakość i ilość uzyskanych bibliotek oceniono za pomocą urządzeń Qubit 2.0 (Invitrogen, Life Technologies) oraz TapeStation 2200. Sekwencjonowanie typu paired-end (75 bp) przeprowadzono na platformie NovaSeq (Illumina) z użyciem zestawów TruSeq SR Cluster Kit v3-CBOT-HS oraz TruSeq SBS Kit v3-HS (Illumina). Kontrolę jakości uzyskanych sekwencji wykonano za pomocą oprogramowania FastQC, a następnie dane przefiltrowano, zachowując odczyty dłuższe niż 36 bp oraz o jakości wyższej niż 20 za pomocą narzędzia Flexbar. Przeprowadzono analizę różnicową w zależności od parametrów jakości nasienia.
Nasienie ogierów
Plemniki są wysoce zróżnicowanymi komórkami ewoluującymi w procesie zapłodnienia i chociaż odnotowano wykrywalne poziomy transkrypcji i translacji podczas końcowych etapów dojrzewania przed zapłodnieniem, zdolność do syntezy nowych składników jest ograniczona. Dojrzewanie plemników po zapłodnieniu, które zachodzi podczas tranzytu plemników przez najądrza i interakcji z biomolekułami żeńskiego układu rozrodczego, ma zasadnicze znaczenie dla utrzymania i funkcjonowania plemników. Płyny otaczające plemniki podczas tego procesu zawierają ważne składniki, takie jak białka, które wiążą się z plemnikami, zmieniają domeny błonowe (proces przebudowy) i modyfikują powierzchnię plemników. Plazma nasienia (SP) zawiera różne rodzaje białek, które są głównie wydzielane przez najądrza i gruczoły dodatkowe, a większość białek SP koni należy do trzech grup: białek transportujących dwa lub cztery moduły fibronektyny typu II (Fn-2), białek wydzielniczych bogatych w cysteinę (CRISP) i spermadhezyn. Białka te są zaangażowane w modulację ochrony plemników przez mechanizmy antyoksydacyjne, kapacytację plemników, reakcję akrosomu, fuzję plemników z oocytami, rozpoznawanie gamet i postkoitalną odpowiedź zapalną w macicy klaczy. Białka są najobficiej występującymi składnikami w komórkach ssaków, stanowiąc 60% suchej masy komórek, a plemniki mają stosunkowo więcej białek błonowych niż wiele typów komórek i nadają się do badań proteomicznych. Charakterystyka SP i białek plemników jest niezbędna do wyjaśnienia ich funkcji w zapłodnieniu. Dlatego celem tego badania było porównanie ilości białek w ekstrakcie z plazmy nasienia i błony plemnikowej przy użyciu narzędzi proteomicznych i porównanie ich pomiędzy ogierami.
Dlaczego to ważne?
- Plemniki po ejakulacji nadal „dojrzewają” – w jajowodzie i w kontakcie z plazmą nasienia.
- Białka obecne w tych płynach mogą:
-chronić DNA i błony komórkowe przed stresem oksydacyjnym
-regulować tzw. kapacytację (końcowy etap przygotowania do zapłodnienia),
-ułatwiać reakcję akrosomu i połączenie z komórką jajową,
-wpływać na odpowiedź zapalną w macicy klaczy.
Jak badaliśmy?
Materiał: nasienie 16 zdrowych ogierów.
Co zrobiliśmy: oddzieliliśmy plemniki, wyizolowaliśmy z nich i z plazmy nasienia białka, a następnie porównaliśmy materiał przy wykorzystaniu proteomiki (2D-elektroforeza + spektrometria mas).
Po co: aby wskazać białka wspólne, unikalne i różnie „wyrażane” pomiędzy ogierami – słowem: znaleźć te, które mogą być kluczowe dla płodności.
Co odkryliśmy? (najciekawsze białka i ich rola)
CRISP3 – białko wydzielnicze bogate w cysteinę; może chronić plemniki i wpływać na ich gotowość do zapłodnienia.
ELSPBP1 – „przylepiec” najądrzowy, który pomaga białkom wiązać się z powierzchnią plemnika.
BSP1 (HSP-1) – białko plazmy nasienia, które przebudowuje błonę plemnika w trakcie kapacytacji.
Clusterin (CLU) – „strażnik jakości”; może stabilizować błony i usuwać uszkodzone składniki.
Peroksiredoksyna-5 (PRDX5) – przeciwutleniacz; gasi „iskry” stresu oksydacyjnego.
Enolaza (ENO1), podjednostka β syntazy ATP (ATP5B), DLD – elementy „elektrowni” komórkowej; wpływają na energię i ruchliwość.
Albumina (ALB) – nośnik i bufor; może ułatwiać wymianę lipidów w błonie plemnika.
Te i inne białka tworzą powiązaną sieć procesów biologicznych – od metabolizmu, przez ochronę antyoksydacyjną, po interakcję z oocytem.
Co to oznacza w praktyce?
Lepsza diagnostyka nasienia: konkretne białka mogą stać się markerami jakości i płodności.
Personalizacja rozrodu: różnice między ogierami sugerują, że ocena proteomu może pomóc dobrać najbardziej skuteczne procedury (rozrzedzacze, chłodzenie, czas inseminacji).
Nowe cele interwencji: wzmacnianie ochrony antyoksydacyjnej lub stabilizacji błon może poprawić przeżywalność plemników.
Jak to zrobiliśmy – prosto i krótko
Separacja plemników: gradient Percoll (40/80%), chłodno i szybko, żeby nie degradować białek.
Izolacja białek: łagodna liza, odwirowanie, oznaczenie stężenia (Bradford).
Oczyszczanie i rozdział: przygotowanie do 2D, ogniskowanie izoelektryczne (pH 3–10), SDS-PAGE.
Identyfikacja: porównanie „spotów białkowych” w oprogramowaniu SameSpot2.0 i identyfikacja z wykorzystaniem spektrometrii mas.
Analiza bioinformatyczna: analiza sieci powiązań białek i procesów biologicznych (STRING, grupowanie).
Czy da się z tego zrobić szybki test?
To krok w tym kierunku. Najpierw trzeba potwierdzić odkrycia w większych grupach i opracować proste testy laboratoryjne.
Czy wyniki pomogą w hodowli?
Tak – docelowo mogą ułatwić selekcję ogierów i zwiększyć skuteczność inseminacji.
Analiza i identyfikacja białek:
Wyniki:
Analiza nasienia pozwoliła na identyfikację białek różniących się pomiędzy nasieniem pobranym od 16 ogierów. Białka zebrano w tabeli 1. Poniżej zaprezentowano również tabele oraz analizy bioinformatyczne zidentyfikowanych białek.
Tabela 1. Białka zidentyfikowane przy użyciu 2d żeli i spektrometrii mas.
| Nazwa białka | Gen/Rodzina |
| Clusterin | CLU |
| Cysteine-rich secretory protein 3 | CRISP3 |
| Epididymal sperm-binding protein 1 | ELSPBP1 |
| Kallikrein1E2 | KLK1E2 |
| Seminal plasma protein A3 | – |
| Seminal plasma protein | HSP-1; BSP1 |
| Spermine synthase | SMS |
| Serum albumin | ALB |
| TBC domain-containing protein kinase-like protein | TBCK |
| Alpha-enolase | ENO1 |
| ATP synthase subunit beta | ATP5B |
| Dihydrolipoyl dehydrogenase | DLD |
| Peroxiredoxin-5 | PRDX5 |
| Small subunit processome | – |